豬肺炎支原體抗原(MP-Ag)ELISA試劑盒 定性常見樣本處理及要求：

【血清樣本】：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4℃過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注意事項：收集血液樣本應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質，這種情況下，ELISA實驗中將會出現非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確，出現假陽性結果。另外，樣本還應避免細菌污染，因為細菌可能含有內源性HRP，也會導致檢測結果不準確。

【血漿樣本】：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注意事項：檢測前請仔細閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。

【細胞培養物上清】：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

【樣品保存】：樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

檢測原理：試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被肺炎支原體（MP）抗體的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），與CUT OFF值相比較，從而判定標本中肺炎支原體抗原（MP-Ag）的存在與否。

豬肺炎支原體抗原(MP-Ag)ELISA試劑盒 定性組成及其配置：

操作步驟：

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加稀釋液40μL；

4.  隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

ELISA試劑盒常見問題解答：

1. 問：96T可以檢測多少個樣本？48T可以檢測多少個樣本？

上海軒澤康生物解答：96T ELISA試劑盒可檢測90個樣本，留6個孔做標準曲線；48T ELISA試劑盒可檢測42個樣本。

2. 問：能否使用自己的稀釋液或者緩沖液？

上海軒澤康生物解答：每個試劑盒中都含有按配方配置的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品被正確稀釋。具體請參看說明書

3. 問：ELISA檢測試劑盒空白對照是什么意思？

上海軒澤康生物答：不加樣本，不加稀釋液，不加酶標試劑。其他都可以加。

4. 問：我是按照實驗步驟進行測定的但是沒有任何信號，這是為什么？

上海軒澤康生物答： 對于使用HRP底物的比色測定，終止液的加入會使底物變色。而說明書推薦的波長就是最適波長。通過輕拍酶標板的邊緣充分混合孔內試劑，加入終止液時顏色由藍變黃。如果加終止液之前孔內試劑沒有混合，則底物顏色變綠。也可能加入試劑的順序錯誤。加入底物溶液以后不要清洗酶標板，在連續稀釋時確定已經加入標準品。如果底物系統中有兩個成份必須混合均勻。同時需確保酶標儀的使用和操作正確。確定試劑、標準品、樣品都正確配置并按照說明滴加無誤。

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